Slik leser vi av koronavirusets arvestoff

​Tekst av: Beathe K. Granerud, PhD stipendiat, Avdeling for mikrobiologi ved Klinikk for laboratoriemedisin (KLM), Oslo universitetssykehus (OUS). Foto: Shutterstock og Lars Petter Devik, OUS. 

Virus vil alltid være i forandring. I møte med vårt immunforsvar vil noen virusvarianter ha en fordel, mens andre har en ulempe.

Koronavirusets arvestoff

Min oppgave som PhD-stipendiat ved Avdeling for mikrobiologi er å finne ut mer om hvordan koronaviruset, SARS-CoV-2, har endret seg i ulike pasienter, ulike deler av pasientens kropp og til ulike tidspunkter under et sykdomsforløp.

Koronaviruset består av arvestoff (enkelttrådig RNA), beskyttet av et proteinskall og en membran. Arvestoffet inneholder oppskriften for byggesteinene som behøves for å kunne lage nye virus.

Når det lages nytt arvestoff vil det kunne skje at noen «bokstaver» (nukleotider) i arvestoffet byttes ut med andre og det oppstår det som kalles «single nucleotide variants» (SNVer).

I møte med vertens immunforsvar, normalflora og så videre, vil noen slike bytter gi viruset en overlevelsesfordel, mens det i andre tilfeller gir det en ulempe.

Det er derfor interessant å lese av koronavirusets arvestoff for å se hvilke SNVer som finnes og hvor de ligger. Dette kan bidra til å gi oss mer kunnskap om hvorfor noen personer blir sykere enn andre, og hvorfor personer har ulike symptomer.

Klipp og plukk

Når vi skal lete etter SNVer benytter vi en metode som kalles «next generation sequencing» (NGS).

Det finnes mange ulike NGS-teknologier på markedet. Vi kan enten lese av en og en lang arvestofftråd om gangen (eks Nanoporeteknologi), eller vi kan klippe den lange tråden opp i små biter og lese av alle de små bitene samtidig for deretter å sy de sammen igjen (eksempel: Illuminateknologi).

I studien Norwegian SARS-CoV-2 studyVirological characterization of inpatients during the COVID-19 outbreak

benyttes Illuminateknologi. Vi må derfor finne en måte å dele arvestoffet opp på, men i tillegg ønsker vi også å kun jobbe videre med de bitene som stammer fra koronaviruset.

Skal vi klippe først og plukke etterpå, eller er det mulig å klippe og plukke samtidig? Det siste alternativet er helt klart det mest arbeids- og tidsbesparende, og det er også dette alternativet som er valgt av norske laboratorier til å overvåke spredningen av ulike varianter i Norge.

Metoden kalles amplikonbasert bibliotekstillaging, og går i bunn og grunn ut på å utføre flere hundre PCR-reaksjoner samtidig – i vårt tilfelle 345 reaksjoner.

Feil under trykking

Selv om amplikonbasert bibliotekstillaking er relativt rask har den også noen ulemper.

I en PCR-reaksjon benyttes to primere, som legger seg på hver sin side av biten man ønsker å kopiere opp. En primer er en kort, enkelttrådig arvestoffbit på cirka 18-30 "bokstaver" (nukleotider/base). Primeren designes for å kunne feste seg til et spesifikt målområde på virusets arvestoff.

Siden virus, særlig RNA-virus, alltid er i forandring vil det kunne skje at målområdet har endret seg siden primeren ble designet. Da klarer ikke primeren å feste seg, eller den fester seg for dårlig. Resultatet vil bli at man ikke får kopiert opp området man ønsker. Om man sammenlikner koronavirusets arvestoff med en bok vil dette bli som å miste deler av en side eller kanskje et helt kapittel.

PCR-reaksjonen krever også en polymerase, et enzym (protein) som gjør  jobben selv med å bygge den nye arvestofftråden med den gamle som mal.

Polymeraser som benyttes i PCR-reaksjoner er svært raskt, men hastverk er lastverk. I blant vil de kunne sette inn feil bokstaver (baser/nukleotider), og de har begrenset evne til å oppdage dette og rette det opp.

Feilinnsettinger skjer relativt sjeldent, men sannsynligheten øker jo flere runder (sykler) man kjører PCR-reaksjonen. Om vi igjen sammenlikner koronavirusets arvestoff med en bok vil det kunne bli vanskelig å finne ut om et feilskrevet ord stammer fra forfatteren eller om det har skjedd en feil i trykkeprosessen. 

Ut på fisketur

En alternativ metode for å plukke ut biter av arvestoff fra koronaviruset er å bruke prober i stedet for primere. Prober likner veldig på primere, men er lenger. De tåler derfor mer variasjon i målområdet de skal binde seg til.

Probene kan limes fast til små, magnetiske kuler. På den måten fungerer de som agn (baits) som kan brukes til å trekke ønskede sekvenser ut fra løsningen ved hjelp av magnetisme. Også i denne metoden trenger vi hjelp av noen runder med PCR for å oppformere materialet vårt.

Metoden har derfor omtrent like stor mulighet for å sette inn gale bokstaver som primerbaserte metoder, men vi unngår i større grad problemet med å miste et eller flere ark eller kapitler i boken.

Ulempen med metoden er at vi ikke kan klippe og plukke ut samtidig, men må klippe først og plukke ut etterpå. Den tar derfor 2-3 dager lenger tid enn amplikonbaserte metoder, og er også dyrere. Baits benyttes av den grunn i større grad i forskningen enn i rutinen.

Å lese et helt bibliotek på en gang

Etter å ha klipt og plukket ut biter med deler av tekst fra koronavirusets arvestoff ønsker vi å lese hva som står på de og sy de sammen til en hel, sammenhengende historie.  Dette gjøres i et instrument som er en kombinert varmeblokk, flowcelle og fotometer.

Det første instrumentet gjør er å kopiere opp bitene enda en gang, slik at du får mange like biter. Deretter leser instrumentet av alle bitene samtidig. Heldigvis må instrumentene kun lese 4 bokstaver og ikke 29. Til slutt samles alle ordene i alle bøkene sammen og sorteres til en sammenhengende historie.

Men måten DET gjøres på er en annen historie.

Lenker:

OUH - Norwegian SARS- CoV-2 study (ous-research.no)

OUH - Covid-19 studies (ous-research.no)

Avdeling for mikrobiologi ved Klinikk for laboratoriemedisin, OUS.

Les flere nyhetssaker om fremtidens pasientbehandling på helse-sorost.no

Her kan du leser flere blogginnlegg fra Ekspertsykehuset!